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基 因 型C58 (rifR) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine (pSoup-tetR)簡 要 說 明EHA105菌株由EHA101菌株改造而來，為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型Ti質粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。在EHA105菌株中轉入help質粒：pSoup即為EHA105 (pSoup)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質粒在農桿菌中復制，同時賦予該菌株四環素（tet）抗性，適用于水稻、煙草等植物的轉基因操作。生物生產的EHA105(pSoup)化學轉化感受態細胞經特殊工藝制作，pGs2(卡那霉素抗性)質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA。 操 作 說 明1. 取-80℃保存的農桿菌感受態于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態時插入冰中。2. 每100 μl感受態加入0.01-1 μg質粒DNA（轉化效率較高，第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量），用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。3. 加入700 μl無抗生素的LB或YEB液體培養基，于28℃振蕩培養2~3小時。4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養72-90 h）。注 意 事 項1. 加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。2. 轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量，本公司生產的GV3101(pJIC SA_Rep)感受態細胞具有四環素抗性，但在轉入目標質粒涂板篩選陽性克隆時，只需加入目標質?？剐缘目股兀患铀沫h素。3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。5. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質粒丟失，但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作，培養農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質粒丟失的概率極低。

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